Кариотип

Кариотип — это систематическое исследование хромосом индивидуума с точки зрения их числа и структуры. Этот анализ является основным методом для выявления генетических заболеваний, оценки врожденных аномалий и определения рисков, связанных с репродуктивным здоровьем.

Процедура кариотипирования выполняется путем окрашивания метафазных хромосом, полученных из клеточной культуры, и их упорядочения под микроскопом. Этот процесс позволяет детально выявлять хромосомные разрывы, транслокации и числовые нарушения.

Пренатальная оценка кариотипа дает возможность исследовать хромосомные структуры плода с помощью амниоцентеза или биопсии хорионических ворсин. Целью этого метода является раннее выявление хромосомных аномалий, таких как синдром Дауна.

Клиническая интерпретация результатов кариотипа основана на оценке фенотипических эффектов выявленных хромосомных вариаций. На этом этапе генетическое консультирование имеет критически важное значение для объяснения возможных рисков заболеваний и определения соответствующих стратегий наблюдения.

Что такое кариотип?

Кариотип — это оценка хромосомной структуры индивидуума путем изучения хромосом под микроскопом с точки зрения их числа и структурных характеристик. Он используется при диагностике генетических заболеваний, проблем с фертильностью и некоторых видов рака. С помощью этого теста можно выявить недостаток, избыток или структурные нарушения хромосом. Кариотипический анализ обычно проводится по образцу крови и оценивается совместно с генетическим консультированием.

Что означают термины кариотип, кариограмма и цитогенетика?

Хотя эти термины в повседневной речи часто используются как синонимы, в лабораторной практике каждый из них имеет особое значение:

• Кариотип: Полный набор хромосом в клетках индивидуума. Это общий взгляд на генетическую архитектуру человека — число, размер и общая форма хромосом.
• Кариотипирование (хромосомный анализ): Лабораторный процесс, используемый для определения этого хромосомного набора. Включает в себя исследование живых клеток:
• Кариограмма: Наглядный результат кариотипирования, то есть фотографическое изображение хромосом. На этом изображении хромосомы цифровым образом упорядочиваются, группируются попарно и, в соответствии с международными стандартами, ранжируются от самых больших к самым маленьким (с 1 по 22). Половые хромосомы (X и Y) располагаются в конце. Это упорядоченное изображение используется для систематического выявления аномалий.

Все эти понятия являются частью цитогенетики — области науки, изучающей связь между строением хромосом и моделями наследования.

Как выглядит нормальный кариотип человека?

Соматическая клетка здорового человека является «диплоидной», то есть содержит два полных набора хромосом — один наследуется от матери, другой от отца. У человека это число составляет 46 (или 23 пары).

Эти 46 хромосом делятся на две категории:

• Аутосомы: 22 пары хромосом, определяющие соматические (телесные) признаки (пронумерованы с 1 по 22).
• Гетерохромосомы (половые хромосомы): 23-я пара, определяющая биологический пол (X и Y).

Международный стандартный формат описания (ISCN) для хромосомно нормального индивидуума:

• Нормальная женщина: 46,XX
• Нормальный мужчина: 46,XY

Все клинические цитогенетические анализы сравниваются с этим «нормальным» стандартом 46,XX или 46,XY. Любое числовое или крупное структурное отклонение от этого стандарта считается хромосомной аномалией.

Как проводится кариотипический (хромосомный) анализ в лаборатории?

Получение кариограммы высокого качества требует точного лабораторного процесса, в ходе которого обычный образец крови превращается в детальное хромосомное «портфолио». Весь процесс основан на фиксации хромосом в определенный момент клеточного деления, когда они наиболее хорошо видны.

Основные этапы процесса:

• Забор образца крови (в пробирки с гепарином)
• Клеточная культура (размножение живых клеток)
• Остановка деления в метафазе (когда хромосомы максимально конденсированы)
• Сбор и фиксация (набухание и стабилизация клеток)
• Бэндинг и окраска (формирование характерного «штрих-кода» каждого хромосомного набора)
• Микроскопический анализ
• Создание кариограммы (цифровое упорядочивание хромосом)

Каковы ограничения кариотипического теста?

Наиболее важной особенностью кариотипического анализа является то, что он требует живых клеток. Поскольку весь процесс зависит от успешной клеточной культуры, у этого метода есть два основных клинических недостатка.

Первый — длительный срок получения результата. Так как клетки должны размножаться в культуре, период от забора образца до выхода окончательного заключения обычно составляет от 1 до 3 недель.

Второй — риск неудачи культуры. Если полученный образец (особенно чувствительные ткани, такие как материал выкидыша) утратил жизнеспособность или был контаминирован по дороге, клетки в культуре не растут, и тест не дает результата. Это особенно серьезная проблема при анализе POC (products of conception — продуктов зачатия).

Какие хромосомные аномалии может выявить кариотипический тест?

Кариотипический анализ может выявлять отклонения от нормального хромосомного набора в двух основных категориях:

Числовые хромосомные аномалии

Это изменения общего числа хромосом в клетке. Обычно они возникают вследствие неправильного расхождения хромосом при формировании яйцеклеток или сперматозоидов.

• Трисомия (наличие трех копий одной хромосомы, например трисомия 21 — синдром Дауна)
• Моносомия (отсутствие одной копии хромосомы, например 45,X — синдром Тернера)
• Полиплоидия (наличие дополнительного полного набора хромосом, например триплоидия)

Структурные хромосомные аномалии

Возникают в результате разрывов хромосом и последующего неправильного воссоединения разорванных участков. При этом генетический материал перераспределяется.

• Транслокация (обмен участками между различными хромосомами)
• Делеция (утрата участка хромосомы)
• Дупликация (наличие дополнительной копии участка хромосомы)
• Инверсия (поворот участка хромосомы на 180 градусов)

Может ли кариотипический анализ выявить все генетические нарушения?

Нет. Это один из важнейших моментов, который необходимо понимать. Кариотипический анализ обеспечивает широкоугольный, «панорамный», но низкоразрешающий «спутниковый» взгляд на хромосомы. Он способен выявлять только очень крупные изменения (обычно более 5–10 мегабаз).

Это означает, что данный метод отлично подходит для выявления числовых аномалий, таких как синдром Дауна, или крупных структурных перестроек (транслокаций), но не может обнаруживать более мелкие, субмикроскопические аномалии, такие как микроделеции или микродупликации.

Поэтому «нормальный» результат кариотипа исключает крупномасштабные хромосомные нарушения, но не устраняет возможность наличия более мелких или затрагивающих отдельный ген генетических дефектов. Именно этот диагностический пробел привел к разработке высокоразрешающих молекулярных методов, таких как хромосомный микроматричный анализ (CMA) и методы секвенирования нового поколения (NGS).

Почему кариотипический тест так важен у пар с повторной потерей беременности (RPL)?

Две и более последовательные потери беременности (RPL) — чрезвычайно тяжелый с эмоциональной точки зрения процесс для пары. Среди множества возможных причин хромосомные нарушения у родителей относятся к немногим факторам, которые можно четко идентифицировать и целенаправленно корректировать.

Основная причина выполнения кариотипического анализа крови у родителей (как у женщины, так и у мужчины) при RPL — выявление сбалансированной структурной перестройки (чаще всего «сбалансированной транслокации»).

Индивид с таким состоянием называется «сбалансированным носителем». Как правило, эти люди полностью здоровы и внешне ничем не отличаются, поскольку их генетический материал в количественном отношении полный; изменено лишь расположение некоторых участков. Проблема возникает на этапе формирования яйцеклеток или сперматозоидов. Во время мейоза перестроенные хромосомы могут неправильно расходиться. Это приводит к образованию значительной доли «несбалансированных» гамет (яйцеклеток или сперматозоидов), которые содержат избыток одного хромосомного сегмента (дупликация) и недостаток другого (делеция).

Когда такая гамета участвует в оплодотворении, образующийся эмбрион оказывается генетически несбалансированным и, как правило, нежизнеспособным. В результате эмбрион либо не может имплантироваться в полость матки (имплантационная неудача), либо беременность заканчивается на раннем сроке самопроизвольным абортом.

Частота выявления значимых хромосомных аномалий (чаще всего сбалансированной транслокации) у пар с RPL составляет от 2 % до 6 %. Это значительно выше, чем примерно 0,2 % в общей популяции. Поэтому кариотипирование является в этой группе пациентов высокоэффективным и обязательным тестом.

Какова роль кариотипического анализа при тяжелом мужском бесплодии (например, азооспермии)?

Между нарушением сперматогенеза (образования сперматозоидов) и хромосомной структурой мужчины существует тесная связь. Особенно в случаях, когда в эякуляте совсем не обнаруживаются сперматозоиды (азооспермия) или их количество крайне низкое (тяжелая олигозооспермия, обычно ниже 5–10 млн/мл), риск наличия генетической (хромосомной) патологии значительно возрастает.

Наиболее частой находкой у мужчин с тяжелым бесплодием являются аномалии половых хромосом, и среди них наиболее распространён синдром Клайнфелтера (47,XXY). Кроме того, в этой группе повышена частота структурных перестроек, таких как транслокации.

У пациентов с необструктивной азооспермией (отсутствие сперматозоидов вследствие нарушения их продукции) частота хромосомных аномалий может достигать 15–19 %.

Технология ИКСИ (ICSI, интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида) позволила многим мужчинам с выраженным дефицитом сперматозоидов стать отцами. Однако ICSI обходит естественные барьеры отбора. Поэтому при наличии у мужчины генетического дефекта (например, транслокации) риск передачи этого дефекта ребёнку с помощью ICSI возрастает. Для оценки этого риска, предоставления паре корректного генетического консультирования, а также постановки важных диагнозов, касающихся здоровья самого мужчины (например, синдром Клайнфелтера), кариотипический анализ в этой группе пациентов обязательно рекомендуется.

Следует ли проводить кариотипический тест при повторных неудачах ЭКО (RIF)?

Повторная неудача имплантации (RIF) — это состояние, при котором, несмотря на перенос, казалось бы, качественных эмбрионов, беременность не наступает. Логика назначения кариотипирования при RIF похожа на подход при повторных выкидышах: сбалансированная транслокация у одного из родителей может приводить к образованию несбалансированных эмбрионов, которые не способны к успешной имплантации.

Тем не менее вклад родительского кариотипа в RIF менее значим, чем его роль в потере беременности. В большинстве случаев основная причина RIF — случайные числовые аномалии (анеуплоидии) в эмбрионах (чаще всего связанные с возрастом матери) или нарушения рецептивности эндометрия.

Исследования показывают, что распространенность хромосомных аномалий у пар с RIF составляет около 2,1 %, что практически не отличается от примерно 2,0 % среди пар, которые только начинают лечение методом ЭКО.

Это свидетельствует о том, что родительский кариотип в большинстве случаев RIF не является ключевым фактором. Поэтому выполнение кариотипирования всем без исключения парам с RIF рутинно не рекомендуется. Вместо этого тест может «рассматриваться» как опция, а решение принимается индивидуально после обсуждения с пациентом низкой вероятности диагностической находки и с учетом его клинического анамнеза.

Что означает выявление «транслокации» в родительском кариотипе?

У части пар, обследуемых по поводу бесплодия или повторных выкидышей, обнаружение того, что один из родителей является «сбалансированным носителем транслокации», становится переломным моментом. На этом этапе кариотипический анализ перестает быть сугубо диагностическим тестом и превращается в первый шаг мощной лечебной стратегии — PGT-SR (преимплантационное генетическое тестирование при структурных перестройках).

Кариотипический отчет родителя обеспечивает базовый «чертеж», на котором строится процесс PGT-SR. Генетическая лаборатория нуждается в этом отчете (с указанием того, какие хромосомы и какие участки вовлечены), чтобы разработать специфический тест для эмбрионов. Эта диагностическая информация позволяет спланировать целенаправленную программу ЭКО, минимизирующую риск выкидыша и переноса несбалансированных эмбрионов.

Как помогает PGT-SR (генетическое тестирование эмбрионов) при носительстве транслокации?

PGT-SR — это специализированная процедура ЭКО, разработанная для максимального повышения шансов на наступление здоровой беременности у пар, в которых один из партнеров является сбалансированным носителем транслокации. Процесс объединяет лечение методом ЭКО с углубленным генетическим тестированием.

Общие этапы процедуры:

• Получение эмбрионов методом ЭКО (пункция яйцеклеток и их оплодотворение сперматозоидами)
• Культивирование эмбрионов до стадии бластоцисты (5–6-й день)
• Биопсия эмбриона (забор 3–5 клеток из внешнего слоя без повреждения эмбриона)
• Генетический анализ (с использованием таких технологий, как NGS, для определения того, является ли эмбрион сбалансированным или несбалансированным относительно транслокации у родителя)
• Замораживание эмбрионов (на период ожидания результатов)
• Выбор и перенос в полость матки «сбалансированного» эмбриона

Цель PGT-SR — выявить генетически «несбалансированные» эмбрионы, возникающие в результате структурной перестройки у родителя. Такие эмбрионы не переносятся. Для переноса выбираются лишь те эмбрионы, чей генетический материал «сбалансирован» (то есть полный). Такой подход существенно снижает риск выкидыша и повышает вероятность рождения здорового ребенка.

Почему важно проводить хромосомный анализ материала выкидыша (POC)?

Выяснение причины потери беременности имеет огромное значение как с эмоциональной, так и с медицинской точки зрения. Генетический анализ материала выкидыша (POC) предоставляет паре и врачу бесценную информацию.

• Высокая частота хромосомных ошибок: Известно, что в 50–60 % случаев выкидышей в первом триместре единственной и наиболее частой причиной являются случайные (спорадические) хромосомные аномалии у эмбриона. Среди них на первом месте — числовые избытки, такие как трисомия 16.
• Эмоциональное облегчение и снятие неопределенности: Узнав, что причиной выкидыша стала случайная хромосомная ошибка, например трисомия 16, пара получает ясное медицинское объяснение. Это часто называют «лучшим вариантом плохого исхода». Такая информация существенно уменьшает чувство вины и тревогу по типу «А вдруг что-то сделала(л) не так?». Осознание того, что потеря была результатом случайного биологического события и что риск повторения той же самой ошибки очень низок, приносит значительное эмоциональное облегчение.

Определение дальнейшей тактики лечения: Результат анализа POC является ключевой точкой для планирования будущих шагов:

• Если POC аномален (анеуплоиден): Это подтверждает диагноз повторяющихся эмбриональных анеуплоидий. Источник проблемы, скорее всего, связан с качеством гамет (особенно яйцеклеток), и в этом случае (особенно при старшем возрасте матери) может быть рекомендовано тестирование эмбрионов, например PGT-A.
• Если POC нормален (эуплоиден): Это убедительно свидетельствует о том, что причина потери беременности не связана с хромосомной патологией эмбриона. Такой результат направляет дальнейшее обследование к негeнетическим причинам RPL (аномалии матки, нарушения свертывания крови, эндокринные расстройства и т.д.) и помогает избежать ненужных генетических тестов.

Почему традиционное кариотипирование затруднено при анализе материала выкидыша?

Хотя генетический анализ материала выкидыша чрезвычайно важен, выполнение его посредством традиционного кариотипирования сопряжено с серьезными техническими трудностями. Все они связаны с тем, что для кариотипирования необходимы живые клетки и успешная культура.

Основные проблемы традиционного кариотипирования POC:

• Высокая частота неудач культуры (фетальные клетки в образце часто теряют жизнеспособность)
• Бактериальная или грибковая контаминация (образец может быть нестерильным)
• Перерастание материнских клеток (Maternal Cell Contamination — MCC, контаминация материнскими клетками)

Последняя проблема (MCC) является наиболее критичной. Образцы POC по своей природе представляют собой смесь фетальной (эмбриональной) и материнской ткани. Во время культивирования более устойчивые материнские клетки могут расти быстрее, чем более чувствительные фетальные. В итоге лаборатория фактически анализирует хромосомный набор матери, а не плода.

В такой ситуации результат «46,XX (нормальная женщина)» становится полностью двусмысленным. Невозможно однозначно сказать, относится ли он к хромосомно нормальному женскому плоду или же отражает клетки матери и маскирует аномальный плод (например, с трисомией 16 или с мужским кариотипом 46,XY). Из-за высокого риска неудачи культуры и MCC в современных условиях для анализа POC отдают предпочтение молекулярным методам, таким как CMA или NGS, которые исследуют ДНК непосредственно из ткани и не требуют клеточной культуры.

Какой генетический тест (кариотип, CMA, NGS) используется сегодня и когда?

В репродуктивной генетике не существует одного «лучшего» теста; существует «правильный тест для правильного клинического вопроса». Кариотип по-прежнему сохраняет статус золотого стандарта, однако сегодня используется в сочетании с более высокоразрешающими молекулярными методами, такими как CMA и NGS.

Применение тестов можно резюмировать следующим образом:

Ситуация: Повторная потеря беременности (RPL) ИЛИ тяжелое мужское бесплодие (азооспермия и т.п.)

• Тест: Кариотипический анализ периферической крови родителей с G-бэндингом

Цель: Поиск структурного носительства, такого как «сбалансированные транслокации». Кариотип — единственный тест, позволяющий визуализировать сбалансированные перестройки.

Ситуация: Анализ материала выкидыша (POC)

• Тест: Хромосомный микроматричный анализ (CMA) или NGS

Цель: С высокой точностью определить причину выкидыша (например, трисомия 16, моносомия X и др.) и при этом исключить риск контаминации материнскими клетками.

Ситуация: Известное носительство транслокации у одного из родителей

• Тест: PGT-SR (на основе NGS) у эмбрионов

Цель: В рамках программы ЭКО выявить несбалансированные эмбрионы и переносить только сбалансированные.

Ситуация: Старший возраст матери ИЛИ повторные неудачи ЭКО (RIF)

• Тест: PGT-A (на основе NGS) у эмбрионов

Цель: Скрининг случайных числовых аномалий (анеуплоидий), возникающих в результате ошибок при формировании яйцеклеток/сперматозоидов, даже если кариотип родителей нормальный.

Что означает «нормальный» результат кариотипа?

Очень важно правильно консультировать пары по поводу интерпретации нормального результата родительского кариотипа (46,XX или 46,XY).

Нормальный результат кариотипа — это очень хорошая новость. Он показывает, что у пары (или у индивидуума) нет крупных структурных и наследуемых хромосомных нарушений. В значительной степени исключается возможность того, что повторные выкидыши или бесплодие обусловлены наследуемой хромосомной патологией, такой как сбалансированная транслокация.

Однако нормальный родительский кариотип не гарантирует, что все эмбрионы пары будут генетически нормальными.

Большинство эмбриональных анеуплоидий (например, трисомия 21 / синдром Дауна) возникает в результате спорадических ошибок в процессе формирования яйцеклеток (реже — сперматозоидов), независимо от хромосомной структуры родителей. Этот риск увеличивается с возрастом матери, даже если кариотип родителей идеален.

Часто задаваемые вопросы