Кариотип

Кариотипът представлява систематичното изследване на хромозомите на даден индивид по отношение на техния брой и структура. Този анализ е основен метод за установяване на генетични заболявания, оценка на вродени аномалии и определяне на рисковете, свързани с репродуктивното здраве.

Процедурата за кариотипен анализ се извършва чрез оцветяване на метафазни хромозоми, получени от клетъчна култура, и подреждането им под микроскоп. Този процес позволява детайлно идентифициране на хромозомни разкъсвания, транслокации и числови нарушения.

Пренаталната оценка на кариотипа дава възможност за изследване на хромозомните структури на плода чрез амниоцентеза или биопсия на хорионни въси. Този метод има за цел ранно откриване на хромозомни аномалии като синдром на Даун.

Клиничната интерпретация на кариотипните резултати се основава на оценка на фенотипните ефекти на установените хромозомни вариации. На този етап генетичното консултиране има ключово значение за обясняване на потенциалните заболявания и за определяне на подходящи стратегии за проследяване.

Какво представлява кариотипът?

Кариотипът е оценка на хромозомната структура на даден индивид чрез изследването им под микроскоп с оглед на техните числови и структурни характеристики. Използва се при диагностика на генетични заболявания, проблеми с фертилитета и някои видове рак. Чрез този тест могат да бъдат открити липсващи, допълнителни или структурно увредени хромозоми. Кариотипният анализ обикновено се извършва от кръвна проба и се оценява съвместно с генетично консултиране.

Какво означават термините кариотип, кариограма и цитогенетика?

Въпреки че тези термини често се използват като взаимозаменяеми в ежедневния език, в лабораторната практика всеки от тях има специфично значение:

• Кариотип: Пълният набор от хромозоми в клетките на даден индивид. Това представлява общ поглед върху генетичната архитектоника на човека – броя, размера и общата форма на хромозомите.
• Кариотипиране (хромозомен анализ): Лабораторният процес, използван за определяне на този хромозомен набор. Включва изследване на живи клетки:
• Кариограма: Визуалният резултат от кариотипирането, т.е. снимката на хромозомите. На нея хромозомите са дигитално подредени, групирани по двойки и подредени по големина (от 1 до 22) съгласно международните стандарти. Половите хромозоми (X и Y) са поставени накрая. Тази подредена картина се използва за систематично откриване на аномалии.

Всички тези понятия са част от цитогенетиката – областта, която изследва връзката между хромозомната структура и моделите на наследяване.

Как изглежда нормалният човешки кариотип?

Соматичните клетки на здрав човек са „диплоидни“, т.е. съдържат два пълни набора хромозоми – един наследен от майката и един от бащата. При човека този брой е 46 (или 23 двойки).

Тези 46 хромозоми се разделят на две категории:

• Аутозоми: 22 двойки хромозоми, които определят телесните характеристики (номерирани от 1 до 22).
• Алозоми (полови хромозоми): 23-тата двойка, която определя биологичния пол (X и Y).

Международният стандартен формат за отчитане (ISCN) при хромозомно нормален индивид е:

• Нормална жена: 46,XX
• Нормален мъж: 46,XY

Всички клинични цитогенетични анализи се сравняват с този „46,XX или 46,XY“ нормален стандарт. Всяко числово или значимо структурно отклонение от тази норма се счита за хромозомна аномалия.

Как се извършва кариотипният (хромозомен) анализ в лабораторията?

Получаването на висококачествена кариограма изисква прецизен лабораторен процес, при който една проста кръвна проба се превръща в детайлен хромозомен портрет. Целият процес е основан на улавянето на хромозомите в определен момент от клетъчното делене, когато те са най-видими.

Основните стъпки на процеса са:

• Вземане на кръвна проба (в хепаринизирани епруветки)
• Клетъчна култура (размножаване на живите клетки)
• Спиране на деленето в метафаза (когато хромозомите са най-кондензирани)
• Събиране и фиксация (набъбване и стабилизиране на клетките)
• Бандиране и оцветяване (създаване на характерния „баркод“ рисунък на хромозомите)
• Микроскопски анализ
• Създаване на кариограма (дигитално подреждане на хромозомите)

Какви са ограниченията на кариотипния тест?

Най-важната особеност на кариотипния анализ е, че изисква живи клетки. Тъй като целият процес зависи от успешно култивиране на клетките, тази техника има два основни клинични недостатъка.

Първият е дългият срок за получаване на резултатите. Понеже клетките трябва да се размножат в култура, времето от вземането на пробата до издаването на окончателния доклад обикновено е между 1 и 3 седмици.

Вторият е рискът от неуспех на културата. Ако взетата проба (особено чувствителни тъкани като абортен материал) е загубила жизнеспособност или е контаминирана по време на транспортиране, клетките не нарастват в култура и тестът остава без резултат. Това е особено сериозен проблем при анализа на POC (products of conception – продукти на зачеването).

Какви хромозомни аномалии може да открие кариотипният тест?

Кариотипният анализ може да разкрие отклонения от нормалното подреждане на хромозомите в две основни категории:

Числови хромозомни аномалии

Това са промени в общия брой на хромозомите в клетката. Обикновено възникват в резултат на неправилно разделяне на хромозомите по време на формирането на яйцеклетки или сперматозоиди.

• Тризомия (наличие на три копия на дадена хромозома, напр. тризомия 21 – синдром на Даун)
• Моносомия (липса на едно копие на хромозома, напр. 45,X – синдром на Търнър)
• Полиоплоидия (допълнителен цялостен набор хромозоми, напр. триплоидия)

Структурни хромозомни аномалии

Те възникват в резултат на разкъсвания в хромозомите и последващо неправилно сливане на разкъсаните краища. Генетичният материал се пренарежда.

• Транслокация (обмен на хромозомни сегменти между различни хромозоми)
• Делеция (загуба на част от хромозома)
• Дупликация (допълнително копие на хромозомен сегмент)
• Инверсия (обръщане на хромозомен сегмент на 180 градуса)

Може ли кариотипният анализ да открие всички генетични проблеми?

Не. Това е един от най-важните аспекти, които трябва да се разберат. Кариотипният анализ осигурява широкообхватен, нискочувствителен „сателитен“ поглед върху хромозомите. Той може да открива само много големи промени (обикновено над 5–10 мегабази).

Това означава, че е отличен за установяване на числови аномалии като синдром на Даун или големи структурни промени като транслокации, но не може да засече по-малки, субмикроскопични аномалии като микроделеции или микродупликации.

Затова „нормален“ кариотипен резултат изключва мащабни хромозомни проблеми, но не отхвърля възможността за по-малки или засягаши единичен ген генетични нарушения. Тази диагностична празнина е причината за разработването на високорезолюционни молекулярни техники като хромозомна микрочипова анализа (CMA) и секвениране от ново поколение (NGS).

Защо кариотипният тест е толкова важен при двойки с повтаряща се загуба на бременност (RPL)?

Две или повече последователни загуби на бременност (RPL) представляват изключително изтощителен процес за двойките. Сред множеството възможни причини хромозомните проблеми при родителите са една от малкото ясно определими и подлежащи на целенасочен подход причини.

Основната причина за извършване на кариотипен анализ от кръв при родителите (както при жената, така и при мъжа) в случаите на RPL е откриването на балансирано структурно пренареждане (най-често „балансирана транслокация“).

Индивид с такова състояние се нарича „балансиран носител“. Обикновено тези хора са напълно здрави и имат нормален външен вид, защото техният генетичен материал е пълен; просто някои сегменти са с променени позиции. Проблемът възниква по време на образуването на яйцеклетки или сперматозоиди. При мейозата пренаредените хромозоми може да не се разделят правилно. Това води до образуване на голям дял „дисбалансирани“ гамети (яйцеклетки или сперматозоиди), които съдържат излишък (дупликация) на един хромозомен сегмент и недостиг (делеция) на друг.

Когато такава гамета участва в оплождането, полученият ембрион е генетично дисбалансиран и обикновено нежизнеспособен. Това може да доведе или до невъзможност за имплантация на ембриона в матката, или до ранен спонтанен аборт.

Честотата на откриване на значима хромозомна аномалия (най-често балансирана транслокация) при двойки с RPL е между 2% и 6%. Този процент е значително по-висок от приблизително 0,2% в общата популация. Поради това кариотипирането е високоефективен и задължителен тест при тази група пациенти.

Каква е ролята на кариотипния анализ при тежък мъжки стерилитет (например азооспермия)?

Съществува силна връзка между нарушената сперматогенеза (образуването на сперматозоиди) и хромозомната структура при мъжа. Особено при случаи, при които в еякулата не се откриват сперматозоиди (азооспермия), или когато броят им е много нисък (тежка олигозооспермия, обикновено под 5–10 милиона/мл), рискът от подлежаща хромозомна аномалия значително се увеличава.

Най-честите находки при мъже с тежък стерилитет са аномалии на половите хромозоми, като най-разпространен е синдромът на Клайнфелтер (47,XXY). Освен това при тази група пациенти по-често се срещат и структурни пренареждания, като транслокации.

При пациенти с необструктивна азооспермия (липса на сперматозоиди поради нарушение в продукцията) честотата на хромозомни аномалии може да достигне 15–19%.

Технологията ICSI (интрацитоплазмено инжектиране на сперматозоид) позволи на много мъже с тежък дефицит на сперматозоиди да станат бащи. Но ICSI заобикаля естествените бариери за селекция. Затова, ако мъжът има подлежащо генетично нарушение (например транслокация), рискът това състояние да се предаде на детето чрез ICSI се увеличава. За да се оцени този риск, да се осигури правилно генетично консултиране и да се поставят важни диагнози, отнасящи се до здравето на мъжа (като синдром на Клайнфелтер), кариотипният анализ се препоръчва задължително при тази група пациенти.

Трябва ли да се назначава кариотипен тест при повтарящ неуспех на имплантация при ин витро (RIF)?

Повтарящият неуспех на имплантация (RIF) описва ситуация, при която, въпреки трансфера на привидно висококачествени ембриони, не се постига бременност. Логиката за кариотипиране при RIF е сходна с тази при повтарящите се аборти: балансирана транслокация при един от родителите може да доведе до образуване на дисбалансирани ембриони, които не успяват да се имплантират.

Въпреки това приносът на родителския кариотип към RIF е по-малко значим в сравнение с ролята му при загуба на бременност. В повечето случаи основната причина за RIF са случайни числови аномалии в ембрионите (анеуплоидии, свързани най-вече с възрастта на майката) или нарушения в рецептивността на ендометриума.

Проучвания показват, че честотата на хромозомни аномалии при двойки с RIF е около 2,1%, което не се различава значимо от приблизително 2,0% при общата популация от двойки, започващи ин витро процедури.

Това показва, че родителският кариотип не е основен фактор в повечето случаи на RIF. Затова рутинното извършване на кариотипиране при всички двойки с RIF не се препоръчва категорично. Вместо това тестът се разглежда като опция, която може да бъде обсъдена индивидуално с пациента, като се вземе предвид ниската вероятност за принос.

Какво означава откриването на „транслокация“ в кариотипа на единия родител?

При подгрупа от двойки, изследвани поради инфертилитет или повтарящи се аборти, откриването, че единият родител е „балансиран носител на транслокация“, е повратен момент. В този момент кариотипният анализ престава да бъде само диагностичен тест и се превръща в първа стъпка от една ефективна терапевтична стратегия – PGT-SR (преимплантационно генетично тестване за структурни пренареждания).

Кариотипният доклад на родителя предоставя основния план, върху който се изгражда процесът на PGT-SR. Генетичната лаборатория се нуждае от този доклад (кой хромозомен регион и кои бандове са засегнати), за да проектира специфичен тест за ембрионите. Тази диагностична находка позволява целенасочено планиране на ин витро лечението, за да се намали рискът от аборти и да се ограничи трансферът на дисбалансирани ембриони.

Как PGT-SR (генетично изследване на ембриона) помага при носителство на транслокация?

PGT-SR е специализирана ин витро процедура, създадена с цел да максимизира шансовете за здрава бременност при двойки, при които единият партньор е балансиран носител на транслокация. Процесът комбинира ин витро оплождане (IVF) с напреднали генетични изследвания.

Основните стъпки на процедурата са:

• Създаване на ембриони чрез IVF (събиране на яйцеклетки и оплождането им със сперматозоиди)
• Култивиране на ембрионите до стадий бластоцист (5-ти или 6-ти ден)
• Биопсия на ембриона (вземане на 3–5 клетки от външния слой без увреждане на ембриона)
• Генетичен анализ (чрез технологии като NGS за определяне дали ембрионът е балансиран или дисбалансиран спрямо транслокацията при родителя)
• Замразяване на ембрионите (докато се изчакват резултатите)
• Избор и трансфер на „балансиран“ ембрион в матката

Целта на PGT-SR е да се идентифицират генетично „дисбалансираните“ ембриони, произтичащи от структурното пренареждане при родителя. Тези ембриони не се трансферират. Избират се само ембриони, чийто генетичен материал е „балансиран“ (т.е. пълен). Този подход значително намалява риска от аборт и повишава шанса за раждане на здраво дете.

Защо е важно да се извършва хромозомен анализ на абортен материал (POC)?

Изследването на причината за загуба на бременност има огромно значение както от емоционална, така и от медицинска гледна точка. Генетичният анализ на абортния материал (POC) предоставя безценна информация за двойките и лекуващите лекари.

• Висока честота на хромозомни грешки: Смята се, че при 50–60% от спонтанните аборти през първия триместър единствената и най-честа причина са случайни (спорадични) хромозомни аномалии в ембриона. Сред тях най-често се срещат числови излишъци като тризомия 16.
• Емоционално облекчение и преодоляване на несигурността: Научаването, че причината за аборта е случайна хромозомна грешка като тризомия 16, дава ясна медицинска причина. Това често се определя като „най-добрият сценарий при лош изход“. То облекчава чувството за вина и честото безпокойство „Дали аз не направих нещо грешно?“. Осъзнаването, че загубата е резултат от случаен биологичен процес и че рискът от повторение на същата грешка е много нисък, дава голяма утеха на двойката.

Насочване на бъдещото лечение: Резултатът от POC анализа е критична отправна точка за бъдещото планиране:

• Ако POC е абнормен (анеуплоиден): Това подкрепя диагнозата повтарящи се ембрионални анеуплоидии. Източникът на проблема най-вероятно е качеството на гамети (особено яйцеклетките), и това (особено при напреднала възраст на майката) може да постави на дневен ред тестове на ембрионите като PGT-A.
• Ако POC е нормален (еуплоиден): Това силно показва, че причината за загубата на бременност не е хромозомен проблем в ембриона. Тази находка насочва диагностичното търсене към други, негeнетични причини за RPL (аномалии на матката, нарушения в кръвосъсирването, ендокринни заболявания и др.) и предотвратява ненужни генетични изследвания.

Защо традиционният кариотипен анализ е труден при абортен материал?

Въпреки че генетичният анализ на абортния материал е изключително важен, извършването му чрез традиционно кариотипиране крие сериозни технически затруднения. Всички те произтичат от зависимостта на кариотипа от култивиране на живи клетки.

Основните проблеми при традиционното кариотипиране на POC са:

• Висока честота на неуспех на културата (феталните клетки в пробата често са загубили жизнеспособността си)
• Бактериална или фунгална контаминация (пробата може да не е стерилна)
• Разрастване на майчините клетки (Maternal Cell Contamination – MCC, контаминация с майчини клетки)

Последният проблем (MCC) е най-критичен. POC пробите по своята същност представляват смес от фетална (ембрионална) и майчина тъкан. По време на култивиране по-издръжливите майчини клетки могат да нарастват по-бързо от по-деликатните фетални клетки. Това води до ситуация, при която лабораторията всъщност анализира майката, а не плода.

Така резултат „46,XX (нормална жена)“ става напълно двусмислен. Не може да се определи дали той отразява хромозомно нормален женски плод, или представлява клетките на майката и прикрива аномален плод (например с тризомия 16 или мъжки кариотип 46,XY). Поради високия риск от неуспех и MCC, днес за POC анализ предпочитание се дава на молекулярни методи като CMA или NGS, които изследват директно ДНК от тъканта и не изискват клетъчна култура.

Кой генетичен тест (кариотип, CMA, NGS) се използва днес и кога?

В репродуктивната генетика няма един „най-добър“ тест; съществува „правилният тест за правилния клиничен въпрос“. Кариотипът запазва мястото си на златен стандарт, но днес се използва съвместно с по-високорезолюционни молекулярни тестове като CMA и NGS.

Приложенията на тестовете могат да бъдат обобщени така:

Ситуация: Повтаряща се загуба на бременност (RPL) ИЛИ тежък мъжки стерилитет (азооспермия и др.)

• Тест: Кариотипен анализ от периферна кръв на двамата родители с G-бандиране

Цел: Търсене на структурно носителство, като „балансирани транслокации“. Кариотипът е единственият тест, който може да открива балансирани пренареждания.

Ситуация: Анализ на абортен материал (POC)

• Тест: Хромозомна микрочипова анализа (CMA) или NGS

Цел: Откриване на причината за аборта (например тризомия 16, моносомия X и др.) с висока успеваемост и елиминиране на риска от контаминация с майчини клетки.

Ситуация: Известно носителство на транслокация при родител

• Тест: PGT-SR (NGS-базирано) върху ембриони

Цел: По време на IVF да се идентифицират дисбалансираните ембриони и да се трансферират само балансирани.

Ситуация: Напреднала възраст на майката ИЛИ повтарящ неуспех при ин витро (RIF)

• Тест: PGT-A (NGS-базирано) върху ембриони

Цел: Скрининг за случайни числови аномалии (анеуплоидии), произтичащи от яйцеклетката/сперматозоидите, дори когато кариотипът на родителите е нормален.

Какво означава „нормален“ кариотипен резултат?

Осигуряването на подходящо консултиране за двойките относно интерпретацията на нормален кариотипен резултат (46,XX или 46,XY) е от съществено значение.

Нормалният кариотипен резултат е много добра новина. Той показва, че двойката (или индивидът) не носи големи структурни или наследствени хромозомни аномалии. До голяма степен се изключва възможността повтарящите се аборти или стерилитетът да се дължат на наследствен хромозомен проблем като балансирана транслокация.

Въпреки това нормалният кариотип при родителите не гарантира, че всички техни ембриони ще са генетично нормални.

По-голямата част от ембрионалните анеуплоидии (като тризомия 21 / синдром на Даун) възникват в резултат на случайни грешки по време на формирането на яйцеклетките (по-рядко – на сперматозоидите), независимо от хромозомната структура на родителите. Този риск нараства с напредване на възрастта на майката, дори когато кариотипът на родителите е напълно нормален.

Често задавани въпроси